碧波DNA Ladder检测试剂盒
一、产品简介
DNA ladder也称DNA fragmentation，是细胞凋亡的一个重要指标。通常观察到DNA ladder，就可以判定细胞发生了凋亡。在细胞发生凋亡时，核酸内切酶被激活，选择性降解染色质DNA，形成50-300 kb的大片段，并进而在核小体连接处断裂，形成180-200 bp或其整倍数的DNA片段，这些DNA片段可从细胞中提取出来，通过琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色呈现为梯状条带（DNA Ladder），并据此判断细胞凋亡产生。DNA Ladder检测试剂盒提供了一种简便、快速地提取染色质DNA的方法，并增加对小片段DNA的回收，从而增强了检测的敏感性。
本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。
二、试剂盒组份
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组份
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Cat:BA1520
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Cat: BA1550
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Cat: BA15100
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储存条件
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裂解液
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4 mL
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10 mL
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20 mL
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4℃
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溶液A
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400μL
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1.0 mL
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2.0 mL
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4℃
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酶1
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400μL
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1.0 mL
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2.0 mL
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-20℃
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酶2
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400μL
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1.0 mL
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2.0 mL
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-20℃
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沉淀液
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3.0 mL
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6.5 mL
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13.0 mL
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4℃
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上样液
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80μL
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0.2 mL
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0.4 mL
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4℃
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三、试剂盒以外自备仪器和试剂
高速离心机、移液器、涡旋振荡器、电泳仪、水浴锅，1.5m L 离心管、PBS、胰酶消化液、冰乙醇、TE Buffer，琼脂糖，TBE、溴化乙啶、DNA Ladder Marker
四、保存条件：
酶-20℃保存。其他溶液可4℃保存
五、注意事项：
1、DNA Ladder出现在细胞凋亡晚期，观察细胞形态已发生皱缩出芽，染色质完全凝聚，细胞核已固缩断裂的凋亡晚期形态，建议该种形态的凋亡细胞比例在30%以上时进行DNA Ladder检测或先进行Tunel检测，
2、 DNA Ladder出现在一个较短的时间段，在凋亡早期取样，则无DNA降解的条带，而在凋亡末期取样则产生与细胞坏死相似的DNA弥散条芾。因此取样时间需根椐不同种类的细胞和诱导剂而摸索确定。
3、贴壁细胞最好不用胰酶消化而用细胞刮收集。
4、某些细胞不产生这种核小体间的DNA断裂，而是产生50-300kb的大片段断裂。
5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
六、操作规程
1、 按常规操作离心收集准备好的105~106细胞（1500×g，离心5min）于1.5mL离心管中；
2、 用PBS洗涤细胞二次（1500×g，离心5min），弃上清；
3、 沉淀的细胞中加入100μL裂解液，涡旋振荡器上剧烈混合10秒，离心（1000×g， 5min）后转移上清于另一1.5mL离心管中；
4、 沉淀再加入100μL 裂解液重复第3步，合并两次的上清液；
5、 在上述合并的上清液中加入20μL 溶液A，再加入20μL 酶 A，轻轻混匀后于55℃反应1小时；
6、 加入20μL 酶 B,轻轻混匀后于37℃孵育1小时；
7、 加入130μL 沉淀液和950μL冰乙醇, 混匀，置-20℃,1小时以上或过夜；
8、 4℃，离心（12，000-14，000 rpm， 15-30min），小心地移弃上清，收集沉淀的DNA；
9、 加入0.5mL 70%的冰乙醇，洗涤DNA沉淀，再离心（12，000-14，000 rpm， 20min）；
10、弃上清，DNA沉淀于室温干燥10 min后，加入10-15μL TE Buffer，充分溶解DNA；
11、取上述10-15μL样品加入2-3μL 上样液， 1.5%琼脂糖凝胶电泳（凝胶和电泳缓冲液TBE均加入0.5μg/mL的溴化乙啶）；
12、5V/cm电泳1小时，紫外灯下观察并拍照。
