一、 原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测水产和鸡肉等组织样本中的己烯雌酚，在微孔条上预包被上偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行的，样本中的己烯雌酚和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗己烯雌酚的抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样品中的己烯雌酚含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出己烯雌酚含量。
二、 试剂盒技术指标：
试剂盒灵敏度： 0.1ppb
样本检测下限：
组织（虾、鱼） 0.1ppb
猪肉/肝 鸡肉/肝 2ppb
饲料 20ppb
尿液 0.6ppb
回收率：
饲料 90±10%
组织 85±10%
尿液 80±10%
交叉反应率：
己烯雌酚 100%
双烯雌酚 35%
己烷雌酚 10%
己炔雌二醇 <0.1%
雌三醇 <0.1%
三、试剂盒组成
1．酶标板：96T/8孔
2．标准品液： 0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb（1.0mL/瓶）
3．酶标记物 12mL
4．抗体工作液 7mL
5．底物缓冲液 7 mL
6．底物液 7 mL
7．终止液 7 mL
8．20倍浓缩洗涤液 50 mL 用去离子水稀释到1000 mL
9．20倍浓缩复溶液 12mL 用去离子水稀释到240 mL
四、样本前处理步骤
样本处理前须知：
1．实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
2．实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。
样本前处理需配制：
配液1：6M H3PO4 100mL 浓H3PO4（含量85%） 加去离子水150mL混合均匀
配液2：1M NaOH 4g NaOH 加去离子水100mL溶解
配液3：2M NaOH 8g NaOH 加去离子水100mL溶解
配液4：乙腈-丙酮 80mL 乙腈 加入丙酮20mL混合均匀
样本的处理：
（a）饲料样本
1．称取2±0.05g捣粹后的饲料样本，加入8mL乙腈，振摇10min，15℃，3000g以上，离心10min；
2．取2mL上清液，60℃氮气/空气吹干；
3．加入0.5mL氯仿，涡动20s，加入2mL 1M NaOH，涡动30s，3000g以上，离心5min；
4．取1mL上清液，加入100µL 6M H3PO4，涡动5s；
不同样本按如下方法稀释：
配合料：取50µL，加入950µL的复溶液，涡动混匀，取50µL /孔用于检测。
浓缩料/预混料：取25µL，加入975µL复溶液，涡动混匀，取50µL /孔用于检测。取50µL用于分析。
配合料稀释倍数：100
浓缩料、预混料稀释倍数：200
（b）组织（鸡肉/肝、猪肉/肝、虾、鱼）
1．称取2±0.05g匀浆后的样本，加入6mL乙腈-丙酮，振摇10min，15℃，3000g以上，离心10min。
2．取3mL上清液，60℃氮气/空气吹干。
加入0.5mL氯仿，涡动20s，加入2mL 2M NaOH，涡动30s，3000g以上，离心5min。
3．取1mL上清液，加入200µL 6M H3PO4，涡动5s。
4．加入3mL乙腈萃取，振荡10min，室温3000g以上，离心10min，取上层有机相， 60℃氮气/空气吹干。
用1mL复溶液溶解干燥的残留物。
不同样本按如下方法稀释：
虾鱼：直接取50µL水相用于检测。稀释倍数：2
猪肉/肝、鸡肉/肝：取50µL水相加入450µL稀释后的复溶液，涡动均匀；取50µL用于检测。
稀释倍数：20
（c）尿液
1．取2mL尿液到离心管中，室温3000g以上，离心10min，直至清亮；
2．移取1mL清亮尿液至离心管中，加入1mL 1M NaOH强烈振荡5min；
3．加入100µL 6M H3PO4，涡动30 s；
4．再加入8mL氯仿进行萃取，振荡10min。15℃，3000g以上，离心10min；
5．去掉上层的水相，取下层有机相4 mL，60℃氮气/空气吹干；
6．用3mL稀释后的复溶液干燥的残留物；
取50µL 用于分析。
样本稀释倍数：6
五、操作步骤
1． 将试剂盒从冷藏环境中取出并将所需试剂从试剂盒取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2． 按需要取出微孔条及板架，将不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷冻。
3． 加标准品/样本50µL /孔，然后加入抗体工作液50µL /孔，再振荡混匀，用封板膜盖板，室温反应30min。
4． 洗板4-5次，每次浸泡30秒，拍干。
5． 加入酶标记物100µL /孔，用封板膜盖板，室温反应20min。
6． 洗板4-5次，每次浸泡30秒，拍干。
7． 显色：每孔加入底物缓冲液50µL，再加底物液50µL，轻轻振荡混匀，25℃环境避光显色10min。
8．测定：每孔加入终止液50µL，轻轻振荡匀，设定酶标仪于450nm处（在20min内读完数据），测定吸光度值。
六、结果判定
以标准品百分吸光率为纵坐标，以己烯雌酚标准品浓度（ng/mL）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中己烯雌酚实际浓度。
七、注意事项
1. 终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
2. 不要使用已过有效日期的孔雀石绿检测试剂盒；不同批次、不同试剂盒之间的试剂等内容不可混用，以免降低灵敏度。
3. 0标准液的A450nm<0.6时，表示试剂可能变质，请勿使用。
4. 显色剂变蓝，表明已变质，请勿使用。
八、储藏条件和保质期
储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，不要冷冻。
保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。
