一、原理
本试剂盒采用固相酶联免疫吸附ELISA原理，通过黄曲霉毒素B1(AFB1)抗原和曲霉毒素B1(AFB1)抗体，待测抗原的竞争免疫反应，以及酶的催化显色反应来检测AFB1，优点是灵敏度高，特异性好，操作简便，结果易判读，适用于食品、饲料及相关原料中AFB1的定量检测。
二、试剂盒技术指标
试剂盒灵敏度：0.1 ppb
回收率： 谷物/饲料中AFB1回收率 95%±15%
变异系数：批内变异系数<10%，批间变异系数<15%。
三、试 剂 盒 组 成
1．微量测试孔： 96T/8孔
2．标 准 液×6瓶：（1 mL/瓶） 0 ppb 0.05 ppb 0.15 ppb 0.45 ppb 1.35 ppb 4.05 ppb
3．抗体工作液 7 mL
3．酶标记物 12 mL
4．底物缓冲液 7 mL
5．底物液 7 mL
6．终止液 7 mL
7．20倍浓缩洗涤液 50 mL 加蒸馏水后稀释到1000 mL。
四、样本前处理步骤
实验准备：配制60 %甲醇水溶液（v/v，60：40）和20 %甲醇水溶液（v/v，20：80）。
注意：请精确配制上述溶液，以免影响检测的准确性。
1 . 脂肪含量低的固体样品（如大米、玉米、小麦和饲料等）
1、称取5 g 粉碎样品于100 mL带塞三角瓶内，准确加入25 mL 60%甲醇水溶液。
2、将加入了甲醇水溶液的样品放入振荡器内（或用手强力振荡），充分振荡3 min后，用滤纸过滤，收集滤液。
3、取滤液2 mL，加入6 mL 20 %甲醇水溶液，混匀，用whatman 1号滤纸过滤，此为样品待检液。
2．酱油、醋
1、称取5 g样品于25 mL小烧杯中，用10 mL蒸馏水将试样转移到125 mL分液漏斗中，加入25 mL三氯甲烷，加塞轻轻振摇3 min，静置分层。
2、放出下层三氯甲烷层，取5 mL于20 mL蒸发皿中，65 ℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入5 mL 60%甲醇水溶液，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。
3、取溶解液2 mL，加入6 mL 20%甲醇水溶液，混匀，此为样品待检液。
3．食用油（如菜油、麻油、色拉油、花生油等）
1、称5 g油样于25 mL小烧杯中，用20 mL石油醚或正乙烷分次将试样转移至125 mL分液漏斗中，准确加入25 mL 60%甲醇水溶液溶液，加塞轻轻振摇5 min，静置分层，放出下层60%甲醇水提取液。
2、取提取液2 mL，再加入6 mL 20%甲醇水溶液，混匀，此为样品待检液。
4．酒类
1、称取5 g样品于125 mL分液漏斗中，加入25 mL三氯甲烷，加塞轻轻振摇3 min，静置分层。
2、放出下层三氯甲烷层，取5 mL于20 mL蒸发皿中，65 ℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入5 mL 60%甲醇水溶液，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。
3、取溶解液2 mL，再加入6 mL 20%甲醇水溶液，混匀，此为样品待检液。
5．花生
1、样品去壳粉碎，称取5 g于100 mL具塞三角瓶中。加入25 mL 60%甲醇水溶液和20 mL正乙烷（或石油醚），振摇10 min，用whatman 1号滤纸过滤。
2、收集滤液于125 mL分液漏斗中，静置分层后放出下层60%甲醇水提取液。
3、取提取液2 mL，再加入6 mL 20%甲醇水溶液，混匀，再用whatman 1号滤纸过滤，此为样品待检液。
6．月饼、桃酥、花生酱等
1、称取5 g粉碎样品于125 mL具塞三角瓶中，准确加入25 mL 60%甲醇水溶液和20 mL正乙烷（或石油醚）加塞震荡10 min，过滤，收集滤液于分液漏斗中，静置分层。
2、待下层甲醇水溶液澄清后，放出甲醇水溶液于另一三角瓶中。吸取10 mL甲醇水提取液于125 mL分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烷，加塞轻轻振摇3 min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，取10 mL于20 mL蒸发皿中，65 ℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入5 mL 60%甲醇水溶液，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。
3、取溶解液2 mL，再加入6 mL 20%甲醇水溶液，混匀，此为样品待检液。
7．面粉、饲料浓缩料
1、称取5 g样品于125 mL具塞三角瓶中，准确加入25 mL 60%甲醇水溶液加塞震荡10 min，过滤，收集滤液。
2、吸取10 mL滤液于125 mL分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烷，加塞振摇3 min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，取10 mL于20 mL蒸发皿中，65 ℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入5 mL 60%甲醇水溶液，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。
3、取溶解液2 mL，再加入6 mL 20%甲醇水溶液，混匀，此为样品待检液。
注意：
1、某些样品待检液(如花生等)久置会影响检测结果的准确性，为保证检测的准确性，样品提取后请即时检测。
2、 若样品待检液不立即检测，请将其存储于棕色玻璃瓶内，2-8 ℃避光保存。
3、 试剂盒在使用前，请将试剂盒内所有试剂放到室内温度（20-25 ℃）进行温度平衡；试剂用完后立即将其放置回2-8 ℃冰箱内保存。
4、 在每个步骤操作时，速度要快，不要将板孔暴露在空气中时间过久，避免酶标板变干。未用完的酶标板需密闭于自封带内，防止受潮且避光保存于2-8 ℃冰箱内。
5、 温育时，需避光，建议将酶标板置于湿盒内(在有盖容器内放置一块平整湿纱布)进行温育。
五、操作步骤：
1．将试剂盒从冷藏环境中取出并将所需试剂从试剂盒取出，置室温（20-25 ℃）平衡30 min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2．按需要取出微孔条及板架，将不用的微孔板重新密封，保存于2-8 ℃，不要冷冻。
3．加标准品/样本50 µL /孔，然后加抗体工作液50 µL /孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，室温下环境反应40 min。
4．洗板4-5次，每次浸泡30 s，拍干。
5． 加入100 µL酶标记物应用液到微孔板中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，室温下反应20分钟。
6．弃去孔中的液体，并在吸水纸上拍干，每孔注满稀释好的浓缩稀释液，轻轻振荡，弃去孔中液体，并在吸水纸上拍干，重复4次。
7．显色：每孔加入底物缓冲液50 µL，再加底物液50 µL，轻轻振荡混匀，室温环境下避光显色10 min。
8．测定：每孔加入终止液50 µL，轻轻振荡匀，设定酶标仪于450 nm处（在20 min内读完数据），测定吸光度值。
六、结果判定
以标准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉毒素B1(AFB1)标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素B1(AFB1)的实际浓度。
七、注意事项
1．室温低于20 ℃或试剂及样本没有回到室温（20-25 ℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2．洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3．混合要均匀，洗板要彻底，否则会出现重复性不好的现象。
4．反应终止液为2 M硫酸，避免接触皮肤。
5．将不用的微孔板放进自封袋重新密封; 标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
6．不要使用过了有效日期的试剂盒，不要使用不同批号试剂盒中的试剂。
7．显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之，0标准的吸光度值小于0.5时，表示试剂可能变质。
八、储藏条件和保质期
储藏条件：试剂盒于2-8 ℃ 保存，不要冷冻。
保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。
