一、原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的苏丹红和微孔条上预包被的偶联抗原竞争苏丹红抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物苏丹红的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应苏丹红的含量。
二、试剂盒技术指标
试剂盒灵敏度： 0.4ppb
样本定量检测下限
水基质（番茄酱、坛坛乡） 0.4ppb
油基质（辣椒油，辣椒酱） 0.4ppb
粉末状（辣椒粉） 1.0ppb
交叉反应率
苏丹1号 ……………………………………………… 100%
苏丹2号 ……………………………………………… ＜1%
苏丹4号 ……………………………………………… ＜1%
对位红 ………………………………………………… 120%
样本回收率
水基质 ……………………………………………… 75±10%
油基质 ……………………………………………… 50±10%
粉末状 ……………………………………………… 65±10%
三、 试剂盒组成
1、微量测试孔：96T
2、 标准品液：（1ml/瓶） 0ppb、0.4ppb、3.2ppb、6.4ppb、12.8ppb、25.6ppb
3、 酶标记物 12ml
4、 抗体工作液 7ml
5、 底物缓冲液破 7ml
6、 底物液 7ml
7、 终止液 7ml
8、 20倍浓缩洗涤液 50ml
9、1mg/ml标准品液：（0.2ml）
四、样本处理
取1g样品（辣椒面、辣椒油、辣椒酱、番茄酱），加入3 mL丙酮溶液，超声震荡20 min，涡旋混合0.5 min，静置10 min， 3000 r/min离心分离10 min，取上清100 μL用PBST稀释10倍至1 mL，取50 μL进行ELISA测定。
五、操作步骤
1. 将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温（20～26℃）下平衡30min以上，将需用的条板固定于支架，按顺序编号；
2. 洗液配制：将50 mL浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水稀释至1000 mL备用。（或按需量稀释）
3. 标准品的配制：先将试剂盒中的1 mg/mL苏丹红标准品用洗液稀释1000倍，变成1000 ng/mL，再用洗液将1000 ng/mL的标准品分别稀释成0.4 ng/mL， 3.2 ng/mL，6.4 ng/mL，12.8 ng/mL，25.6 ng/mL。（现配现用）
4. 在标准品孔中加入50 μL标准品，样品孔加入50 μL待测样品，然后每孔加入50 μL抗体（加入标品和样品时无时间差的影响），轻拍混匀，37℃下孵育30min；
5. 倒出孔中的液体，以试剂盒浓缩洗液稀释20倍后作为洗液，用洗板机洗涤4～6遍；没有洗板机的用户可用300 μL洗液充入各孔中，静置20 s，倒出孔中的液体，将微孔架倒置，在吸水纸上连续拍打3次以上，以保证完全除去孔中的液体，重复操作4～6遍；
6. 每孔加入酶标记物100 μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃ 环境中反应20 min ，取出重复洗板步骤。
7. 显色：每孔加入底物缓冲液50 μL，再加底物液50 μL．轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，置37℃ 环境中反应10 min。
8. 测定：每孔加入终止液50 μL，轻轻振荡混匀．设定酶标仪于450 nm处（建议用双波长450/630 nm 检测，在20 min内读完数据），测定每孔OD 值，根据标准曲线计算样品浓度。
标准样品配制方法：
（1）准备5个1 mL瓶子，其中一个加入1000 μL洗液，一个加入700 μL洗液，其余的分别加入500 μL洗液。
（2）在1000 μL洗液瓶子中先吸出25.6 μL的洗液，然后加入25.6 μL的1000 ng/mL标准品，
混匀，使其浓度为25.6 ng/mL，作好记号；
（3）再从25.6 ng/mL的瓶子中吸出500 μL加入其中一个500 μL洗液的瓶子中，使其浓度为12.8 ng/mL，混匀，作好记号；
（4）再从12.8 ng/mL的瓶子中吸出500 μL加入其中一个500 μL洗液的瓶子中，使其浓度为6.4 ng/mL，混匀，作好记号；
（5）再从6.4 ng/mL的瓶子中吸出500 μL加入其中一个500 μL洗液的瓶子中，使其浓度为3.2 ng/mL，混匀，作好记号；
（6）再从3.2 ng/mL的瓶子中吸出100 μL加入其中一个700 μL洗液的瓶子中，使其浓度为0.4 ng/mL，混匀，作好记号。 （加样前应将标准品充分混匀，配好后在半小时内使用）
七、 结果判定
以标准品百分吸光率为纵坐标，以苏丹红标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中苏丹红实际浓度。
八、 注意事项
1．室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2．洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3．混合要均匀，洗板要彻底，否则会出现重复性不好的现象。
4．反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5．将不用的微孔板放进自封袋重新密封; 标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
6．不要使用过了有效日期的试剂盒，不要使用不同批号试剂盒中的试剂。
7．显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之，0标准的吸光度值小于0.6时，表示试剂可能变质。
8．该试剂盒最佳反应温度为25 ℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
九、储藏条件和保质期
储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，不要冷冻。
保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。
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