一、原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的三聚氰胺和微孔条上预包被的偶联抗原竞争三聚氰胺抗体，加入酶标记物后，用底物显色，样本吸光值与其所含残留物三聚氰胺的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应三聚氰胺的含量。
二、试剂盒检测限
试剂盒检测限： 10 ng/mL
三、 试剂盒组成
1．预包被板：96T
2．标准品液：（1mL/瓶） 0 ng/mL、20 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL
3．酶标记物 12 mL
4．抗体工作液 7 mL
5．底物缓冲液 7 mL
6．底物液 7 mL
7．终止液 7 mL
8．20倍浓缩洗涤液 50 mL
四、样本处理
配制样品稀释液：
称取89.5 g Na2HPO4·12H2O ，蒸馏水定容至1000 mL。
湿的宠物食品萃取方法（稀释100倍）
1．匀质样品到布丁状；
2．称取2 g样品加入10 mL 60%甲醇水溶液，并剧烈振荡；
3．超声萃取1 min，漩涡混合1 min，然后静止5 min，使样品分层；
4．5000 r/min室温离心5 min，用玻璃纤维滤纸过滤上清液，并将其收集于干净试管中；
5．用样品稀释液将滤液20倍稀释；
6．取50 μL进行实验。
干的宠物食品萃取方法（稀释200倍）
1．均质干的宠物饲料样品；
2．称取1 g样品加入10 mL 60%甲醇水溶液，并剧烈振荡；
3．超声萃取1 min，漩涡混合1 min，然后静止5 min，使样品分层；
4．5000 r/min室温离心5 min，用玻璃纤维滤纸过滤上清液，并将萃取液收集于干净试管中；
6．用样品稀释液将滤液20倍稀释；
7．取50 μL进行实验。
液态奶/乳饮料（稀释5倍）
1． 准确吸取1 mL液态奶或乳饮料于干净离心管中，冷藏至4℃备用；
2． 将1 mL液态奶或乳饮料样品置于离心机中，5000 g离心10 min（建议10℃低温离心），分离样品中脂肪；
3． 弃上层脂肪，取0.2 mL离心后的脱脂液态奶或乳饮料试样于干净试管中；
4． 加入0.8 mL样品稀释液于离心后的脱脂液态奶或乳饮料中，振荡混匀样品，取50 μL进行实验。
奶粉（稀释25倍）
1． 称取1 g奶粉样品于干净试管中；
2． 加入5 mL的45～50℃温水溶解奶粉并混匀后冷藏至4℃备用；
3． 取1 mL溶解好的奶粉试样于离心管中，5000 g离心10 min（建议10℃低温离心），弃上层脂肪，取0.2 mL试样于干净试管中；
4．加入0.8 mL样品稀释液于试管中，振荡混匀取50 μL进行实验。
酸奶：（稀释5倍）
1． 准确吸取1 mL液态奶或乳饮料于干净离心管中，将PH值调至6～8，冷藏至4℃备用；
2． 将1 mL样品置于离心机中，5000 g离心10 min（建议10℃低温离心），弃上层脂肪，取0.2 mL试样于干净试管中；
3． 加入0.8 mL样品稀释液于试管中，振荡混匀取50 μL进行实验。
初乳样品：（稀释1倍）
直接法：将样品4℃冷藏30 min后，4000 r/min离心15 min，弃去上层脂肪，取50 μL进行实验。
五、操作步骤
1．将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温（20～26℃）下平衡30min以上，将需用的板条放入支架，按顺序编号；
2．洗液配制：将50 mL浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水稀释至1000 mL备用（或按需量稀释）；
3．在标准品孔中加入50 μL标准品，样品孔加入50 μL待测样品，然后每孔加入50 μL抗体（加入标品和样品时无时间差的影响），轻拍混匀，37℃下孵育40 min；
4．倒出孔中的液体，用洗板机洗涤4～6遍；没有洗板机的用户可用300 μL洗液充入各孔中，静置20 s，倒出孔中的液体，将微孔架倒置，在吸水纸上连续拍打3次以上，以保证完全除去孔中的液体，重复操作4～6遍；
5．加入酶标记物100 μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃ 环境中反应20 min，取出重复洗板步骤；
6．显色：每孔加入底物缓冲液50 μL，再加底物液50 μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，置37℃ 环境中反应10 min；
7．测定：每孔加入终止液50 μL，轻轻振荡混匀．设定酶标仪于450 nm处，测定每孔OD 值，根据标准曲线计算样品浓度。
六、 结果判定
以标准品百分吸光率为纵坐标，以三聚氰胺标准品浓度（ng/mL）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中三聚氰胺实际浓度。
七、 注意事项
1．试剂及样本没有回到室温（20～26℃）会导致所有标准的OD值偏低；
2．洗板拍干后应立即进行下一步操作；
3．混合要均匀，洗板要彻底，否则会出现重复性不好的现象；
4．反应终止液为2 mol/L硫酸，避免接触皮肤。
5．将不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下；
6．不要使用过了有效日期的试剂盒，不要使用不同批号试剂盒中的试剂；
7．显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之，0浓度标准品的吸光度值小于0.6时，表示试剂可能变质；
8．该试剂盒最佳反应温度为37 ℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
八、储藏条件和保质期
储藏条件：试剂盒于2～8℃保存，不要冷冻。
保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。
