一、 原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测水产和鸡肉等组织样本中的硝呋索尔，在微孔条上预包被上偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行的，样本中的硝呋索尔和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗硝呋索尔衍生物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样品中的硝呋索尔含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出硝呋索尔含量。
二、 试剂盒技术指标：
试剂盒灵敏度： 0.1ppb
样本检测下限：
组织、蜂蜜 0.2ppb
鱼/虾等水产品组织因存在一定的干扰，检测下限为0.3ppb
回收率：
鱼/虾水产组织 90%±15%
蜂蜜/鸡肉/肝脏样本 80%±15%
交叉反应率：
硝呋索尔代谢物 100%
呋喃唑酮代谢物 ﹤0.1%
呋喃妥因代谢物﹤0.1%
呋喃西林代谢物﹤0.1%
三、试剂盒组成
1．微量测试孔：96T/8孔
2．标准品液： 0ppb 0.1 ppb 0.3ppb 0.9ppb 2.7ppb 8.1ppb （1ml/瓶）
3．酶标记物 12ml
4．抗体工作液 7ml
5．底物缓冲液 7 ml
6．底物液 7 ml
7．终止液 7 ml
8．20倍浓缩洗涤液 50 ml
9．复溶液 50 ml
10．15.1mg衍生化试剂
四、 所用仪器、试剂
具备的仪器： 微孔酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）
微量移液器： 单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道250µl
试 剂： 甲醇、氢氧化钠、乙酸乙酯、正己烷、浓HCl、磷酸氢二钾、邻硝基苯甲醛、亚硝基铁氰化钾（K2Fe（CN）5·NO·3H2O）ZnSO4·7H2O
五、样本前处理步骤
样本处理前须知
处理任何样本时，都必须注意：
（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。
样本前处理需配制：
1．衍生化试剂 称15.1mg邻硝基苯甲醛加甲醇10ml溶解(浓度10mM)
2．C液：（供奶样用）称12.5g亚硝基铁氰化钾用去离子水定溶至100ml。
D液：（供奶样用）称29.8g 硫酸锌用去离子水溶解定溶至100ml。
3．0.1M K2HPO4 称22.8g K2HPO4·3H2O
加去离子水溶解定溶至1L
4．1M HCl取8.6ml浓HCl加水定溶至100ml。
5．1M NaOH称取4g NaOH加水定溶至100ml。
样本的处理
(a) 肉样或鱼虾
用均质器均质样本,接（d）的描述方法
(b) 奶样
1. 取出5ml的奶样本到玻璃离心管中,分别加入C液和D液各250µl。
2. 用振荡器充分混合样本,用恒温离心机4000r/min以上离心10min(4-12℃).若没有恒温离心机,则先将样本降温至大约8℃,然后离心。
3. 接(d)的描述方法
(c) 蜂蜜
1. 取1±0.05g样本到离心管中。
2. 加入4ml的去离子水溶解,再加入0.5ml 1M HCl和100µl衍生化试剂,充分振荡。
3. 接(d)第2步描述方法
(d)接上面的方法
1. 取1±0.05g的均质样本(肉样/鱼虾)、牛奶的离心上清液1.1ml（相当1ml奶样），分别加入4ml的去离子水，0.5ml 1M HCl和100µl衍生化试剂，充分振荡。
2. 置于56℃环境中孵育（2h）。
3. 分别加入5ml 0.1M K2HPO4， 0.4 ml 1M NaOH和5ml的乙酸乙酯，充分振荡30s；
4. 在室温下（20-25℃）4000r/min以上离心10min。
5. 取出2.5ml的乙酸乙酯到另一洁净容器中于50℃氮气/空气吹干。
6. 用1ml正己烷溶解干燥物，用1ml已稀释好的复溶液充分混合；在室温下（20-25℃）4000r/min以上离心10min。
7. 取50µl下层相用于分析。
样本稀释倍数：2
六、操作步骤
1． 将试剂盒从冷藏环境中取出并将所需试剂从试剂盒取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2． 按需要取出微孔条及板架，将不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷冻。
3． 加标准品/样本50µl /孔，然后加入抗体工作液50µl /孔，再振荡混匀，用封板膜盖板，室温反应30min。
4． 洗板4-5次，每次浸泡30秒，拍干。
5． 加入酶标记物100µl /孔，用封板膜盖板，室温反应20min。
6． 洗板4-5次，每次浸泡30秒，拍干。
7．显色：每孔加入底物缓冲液50µl，再加底物液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境避光显色10min。
8．测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡匀，设定酶标仪于450nm处（在20min内读完数据），测定吸光度值。
七、结果判定
以标准品百分吸光率为纵坐标，以硝呋索尔标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中硝呋索尔实际浓度。
八、注意事项
1．室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2．洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3．混合要均匀，洗板要彻底，否则会出现重复性不好的现象。
4．反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5．将不用的微孔板放进自封袋重新密封; 标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
6．不要使用过了有效日期的试剂盒，不要使用不同批号试剂盒中的试剂。
7．显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之，0标准的吸光度值小于0.6时，表示试剂可能变质。
8．该试剂盒最佳反应温度为25 ℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
九、储藏条件和保质期
储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，不要冷冻。
保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒
