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1.         原理

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的孔雀石绿结晶紫和微孔条上预包被的偶联抗原竞争孔雀石绿抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物孔雀石绿结晶紫的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应孔雀石绿结晶紫的含量。

 

2.     试剂盒组成

（1）       酶标板：   96 T/8孔

（2）       标准品液:（1.0 mL/瓶）0 ppb、0.05 ppb、0.15 ppb、0.45 ppb、1.35 ppb、4.05 ppb。

（3）       酶标记物：     1瓶（12 mL）。

（4）       抗体工作液：   1瓶（7 mL）。

（5）       底物缓冲液：   1瓶（7 mL）。

（6）       底物液：       1瓶（7 mL）。

（7）       终止液：       1瓶（7 mL）。

（8）       20倍浓缩洗液：1瓶（50 mL）加蒸馏水稀释到1000 mL。

（9）       1 mg/mL标准品液：（0.2 mL）。

（10）   提取液A （50 mL）

（11）   提取液B （50 mL）

 

3.         需要但试剂盒中不提供的器材和试剂

…微孔板酶标仪(450 nm)

…均质器

…振荡器

…离心机

…各种量程的微量移液器

…蒸馏水

…环已烷

 

5.         储存条件

（1） 2-8 ℃保存，切勿冷冻。　

（2） 将不用的酶标板放进原袋中重新密封。

（3） 酶标记物和显色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

 

6.         样品处理

（1）       鱼/虾样品的准备（稀释倍数10）

     先将鱼肉匀质后，称取0.5 g样品，加入500 μL的0.125 mol/L(Ph4.5)乙酸缓冲液，200ul的0.25g/mL盐酸羟胺，300ul的0.05mol/L对甲苯磺酸，震荡15分钟使之成匀浆，12000rpm离心5min，然后取上清用PBST稀释5倍，用作ELISA检测

（2）       水质样品（稀释倍数1）离心后取50µl作ELISA分析。

 

7.         免疫分析时试剂的准备

（1）注意事项

A）使用之前将所有试剂平衡至室温。

B）使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。

C）在使用中不要让微孔干燥。

D）EIA分析的重复性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是EIA测定程序中的要点。

E）在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。

（2）浓缩洗涤液使用前应根据所需量进行20倍稀释，即按1mL浓缩洗涤液加入19mL蒸馏水的比例进行稀释。

 

8.         标准样品配制方法：

（1）用稀释好的洗液将1mg/mL的标准品液稀释1000倍，变成1000ng/mL，振荡混匀。

（2）准备5个1 mL瓶子，其中一个加入1000 μL洗液，其余的分别加入600 μL洗液。

（3）在1000 μL洗液瓶子中先吸出4.05 μL的洗液，然后加入4.05 μL的1000 ng/mL标准品，混匀，使其浓度为4.05 ng/mL，作好记号；

（4）再从4.05ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一个600 μL洗液的瓶子中，使其浓度为1.35 ng/mL，混匀，作好记号；

（5）再从1.35 ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一个600 μL洗液的瓶子中，使其浓度为0.45 ng/mL，混匀，作好记号；

（6）再从0.45 ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一个600 μL洗液的瓶子中，使其浓度为0.15 ng/mL，混匀，作好记号；

（7）再从0.15ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一个600 μL洗液的瓶子中，使其浓度为0.05 ng/mL，混匀，作好记号。

 

9.         测定程序

（1）将标准品、样品所需微量反应板（均需2个平行试验）放在反应架上。

（2）加入50μl的标准液或处理好的样品到各自的微孔板中。

（3）加入50μl已稀释的抗体应用液加入微量反应板，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，室温下反应20分钟。

（4）弃去孔中液体，并将微孔板剩余残液在吸水纸上拍干。每孔注满稀释好的洗液，轻轻振荡，放置2分钟，弃去孔中液体，并在吸水纸上拍干，重复5次。

（5）加入100μl酶标记物应用液到微孔板中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后， 室温下反应15分钟。

（6）弃去孔中的液体，并在吸水纸上拍干，每孔注满稀释好的洗液，轻轻振荡，放置2分钟，弃去孔中液体，并在吸水纸上拍干，重复5次。

（7）加底物缓冲液50μl，再加入底物液50μl，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，在室温避光处孵育10分钟。

（8）加入50μl终止液到微孔板中，混合好在450nm处测量吸光度值，在加入停止液后10分钟内读取光度值。

 

10.   结果

以标准品百分吸光率为纵坐标，以孔雀石绿标准品浓度（ng/mL）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中孔雀石绿实际浓度。

 

11.   测定技术指标

（1）      灵敏度：

孔雀石绿检测试剂盒的平均检测下限约为0.01ng/g（0.01ppb）。

（2）           准确度（回收率）：回收率为90%±15%。

 

12.   交叉反应活性

孔雀石绿检测试剂盒能检测孔雀石绿及其相似物，它们的结合程度不同。以下表格中展示的是相关值及交叉反映率（%CR），所有浓度均为ppb级。

种类	% CR
孔雀石绿	100%
隐性孔雀石绿	<10%
结晶紫	100%
隐性结晶紫	<10%